用于治疗肌肉萎缩的外显子跳跃组合物
2020-01-10

用于治疗肌肉萎缩的外显子跳跃组合物

本发明描述了能够结合在人类抗肌萎缩蛋白基因中的选定的靶标位点以诱发外显子53跳跃的反义分子。

Ry选自氢X1-C6烷基、核苷酸、细胞穿透肽部分、氨基酸、甲脒基和C1-C6酰基;且

其医药学上可接受的盐。

除非另外定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在实施或测试本发明中可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等价的任何方法和材料,但是描述了优选的方法和材料。对于本发明的目的,以下术语如下定义。

所要求主题的反义寡核苷酸的例示性主链结构包括在图ID-G中示出的吗啉亚基型,其各自由不带电或带正电的含磷亚基键连接。图ID示出含磷键,其形成5-原子重复单元主链,其中吗啉环由1-原子磷酰胺键连接。图IE示出生成6-原子重复单元主链的键。在该结构中,连接5’吗啉碳到磷基团的原子Y可为硫、氮、碳或优选氧。在磷侧位的X部分可为氟、烷基或取代的烷基、烷氧基或取代的烷氧基、硫代烷氧基或取代的硫代烷氧基、或未被取代的、被单取代或二取代的氮,包括环状结构,例如吗啉或昵啶。烷基、烷氧基和硫代烷氧基优选包括1-6个碳原子。Z部分为硫或氧,且优选为氧。

在另一实验中,与公开的反义寡核苷酸相比较,测试本发明的反义寡聚体在原代人类肌母细胞中的外显子53跳跃。除了上述的H53A(+23+47)(SEQIDN0:9)之外,将来自US8,232,384的H53A(+39+69)、H53A(+39+62)和H53A(+45+69)(分别地SEQIDNO:10、11和12);来自W02004/083446的h53A0Nl(+45+62)(SEQIDN0:13);和来自W02012/029986的PM03(+32+56)和PM08(+36+56)(分别地SEQIDNO:14和15)与本发明的例示性寡聚体H53A(+36+60)(SEQIDN0:1)相比较。如在图5A和5B中所示,说明最低EC50的寡聚体被确定为H53A(+36+60)SEQIDNO:1。这通过对结果进行在GraphPadPrism程序中的三参数回归分析以产生如在下表中所示的EC50值来证实。

尽管取得了这些成果,但是仍然需要靶向多种抗肌萎缩蛋白外显子的改进的反义寡聚体及用于DMD治疗应用的改进的递送组合物和方法。

对于长度多达约25个亚基的寡聚体,优选具有接近500ymol/g树脂的装载量的氨基甲基聚苯乙稀-二硫化物树脂。对于较大的寡聚体,优选具有300-400ymol/g的树脂的装载量的氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物树脂。如果期望具有5’-尾的分子,则在相同装载准则下选择已经装载尾物质的树脂。

氨基甲酸酯醇36的制备:将氢化钠(1.2当量)悬浮在1-甲基-2-吡咯烷酮(32mL/g氢化钠)中。向该悬浮液中加入三乙二醇(10.0当量)和化合物35(1.0当量)。将所得浆液加热到95°C。在反应完成(1-2小时)后,将混合物冷却到20°C。向该混合物中加入30%二氯甲烷/甲基叔丁基醚(v:v)和水。将含有产物的有机层用水性NaOH、水性琥珀酸和饱和水性氯化钠依次洗涤。产物36通过自二氯甲烷/甲基叔丁基醚/庚烷中结晶而分离。

通过在各种指示浓度下处理原代人类肌母细胞来对于外显子跳跃功效评价上述反义寡聚体。在这些实验中,将对应于H53A(+33+60)和H53A(+31+55)的反义寡聚体用作比较寡聚体。如在图3和图4中所示,寡聚体H53A(+36+60)(SEQIDN0:1)在诱发在原代人类肌母细胞中的外显子53跳跃方面非常有效。H53A(+31+55)(SEQIDN0:7)和H53A(+22+46)(SEQIDNO:8)也诱发外显子53跳跃,但程度不如H53A(+33+60)(SEQIDNO:6)和H53A(+36+60)(SEQIDN0:1)。如在图3中所示,H53A(+33+60)和H53A(+36+60)(分别SEQIDN0:6和SEQIDNO:1)与其它高活性反义寡核苷酸相比较在诱发在培养的肌母细胞中的外显子53跳跃方面非常有效。

III.制剂和施用模式